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KAPA在Illumina测序平台上进行靶向重测序而制备

发布时间: 2020-03-30  点击次数: 363次

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KAPA hgDNA定量&QC试剂盒,包含人类基因组DNA样品NGS文库构建前,所有基于qPCR定量及质量评估的试剂。

KAPA hgDNA定量&QC试剂盒,是基于SYBR Green I染料法优化的高质量qPCR检测试剂盒,包含KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix预先稀释的一系列DNA标准品,以及针对于人类基因组单拷贝的高度保守区域的不同位点所设计的引物预混液。最小片段所对应的引物,用于获得绝对定量的结果,而额外的引物,用于获得在DNA样本中可扩增模板量(质量高的DNA片段)的信息。这个试剂盒由此所产生的质量分数(即Q-ratios),可以用于预测文库的产量,或者对于如FFPE DNA这类样本质量变化很大的样本的工作流程进行调整。

产品特色

在单次检测中,同时评估样本量以及样本质量

可以将质量分数(Q-ratios)与测序相关指标相关联

高性能的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix

预先稀释好的DNA标准品以及可以直接使用的引物

多功能、易于自动化的工作流程

建立样本质量控制中最低条件

指示样品是否有足够的量以及质量来成功构建文库

未通过质控的样本,不再进行后续文库构建以及测序步骤,从而节约时间和精力

通过检测进行测序的样本 (Sequenced Sample) 和Q值不够、未进行测序的样本(QNS,Not Sufficient) 各自的Q-ratios。

数据来源于Dartmouth-Hitchcock医疗中心(DHMC)的转化医学实验室。在DNA抽提后以及文库构建之前,使用KAPA hgDNA定量&QC 试剂盒,可以帮助使用者建立一个额外的质量控制流程,用于在早期的过程中预测测序的质量。DHMC在其扩增子测序工作流程中,根据经验,使用Q129/41 bp>0.5和Q305/41 bp > 0.2作为判断标准。

分析NGS文库构建工作流程

Q-ratios可以帮助判断NGS文库构建工作流程中的瓶颈

对于FFPE样本,文库质量和测序中质量的主要限制因素是:起始DNA转化成连接有接头的文库分子的转化率不高

文库的转化率,为在Illumina测序平台上进行靶向重测序而制备

分别从样本质量参差的80-100 ng FFPE DNA样本(橙色)和商用人类基因组DNA(灰色),使用KAPA LTP文库构建试剂盒来构建测序文库。FFPE DNA样本在用Covaris打断之前,用KAPA hgDNA定量&QC试剂盒进行检测,然后按照Q-ratios(DNA质量)沿X轴升序排列。Q-ratios如图中标注。片段化的DNA(平均大小在180 bp左右)在建库之前,用Qubit® HS dsDNA (Life Technologies) 进行定量;在连接接头、形成文库分子之后,使用基于qPCR的KAPA文库定量试剂盒进行定量。结果显示,FFPE样本的文库转化率(Conversion Rate,起始DNA分子转化成连接有接头的文库分子的百分比,%)明显低于高质量的DNA样本,使得FFPE样本的文库分子多样性受到限制,并且需要在文库扩增步骤中采取更多的循环数才能得到足够多的文库分子进行靶标捕获,从而使FFPE样本的文库的重复率(duplication rate) 更高,靶标覆盖率(target coverage)更低。

从FFPE DNA样本中获得样本制备的可操作数据

 

Q129/41 比值和测序中的关键指标(如重复率)具有相关性

从250 ng Covaris打断的FFPE DNA样本(n=14)和对照组DNA(分别从培养细胞、新鲜冰冻样本和血液中提取,n=6),进行手动文库构建。样本按照Q129/41-比例升序在x轴上从左至右排列(FFPE样本用黄色表示,对照组DNA用橙色表示)。文库构建采用的是NEBNext® 试剂(New England Biolabs),其中靶标捕获前和靶标捕获后的扩增环节(10个循环)采取KAPA HiFi 试剂盒。靶标捕获使用的是定制的SeqCap EZ panel (300 genes,0.9 MB)。 在Illumina HiSeq平台上进行了测序(2 x 100 bp)。FFPE样本的平均靶标覆盖率(蓝色点)是对照组的四倍(1,247X, vs. 301X),平均重复率(红色点)是对照组的两倍(75% vs. 38%)。Q129/41 比值 > 0.4 的FFPE样本所产出的文库能够达到最低测序质量要求。

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