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PCR仪反应时dNTP和Mg2+充当的角色

发布时间: 2021-12-23  点击次数: 49次
   PCR仪采用荧光定量检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、肝炎病毒、流感病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
  PCR仪的反应过程中dNTP和Mg2+充当的什么样的角色呢?
  脱氧核苷酸是DNA的基本组成元件,为DNA合成所必需。PCR中使用脱氧核苷酸通常是4种脱氧核苷酸的等摩尔混合物,即dATP(腺嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)、dGTP(鸟嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)、dCTP(胞嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸)和dTTP(胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸),通常统称为dNTP。
  PCR扩增效率和dNTP的质量与浓度有密切关系,dNTP干粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度,以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的缓冲液为宜,pH调节到7.0-7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP的浓度应为50-200μmol/L,尤其注意4种dNTP的浓度要相等(等物质的量配制),如其中任何一种浓度不同于其他几种时(偏高或偏低),就会增加错配概率。dNTP浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
  反应体系中游离Mg2+的浓度对PCR反应中耐热DNA聚合酶的活性、PCR扩增的特异性和PCR产物量有显著的影响。反应体系中Mg2+浓度低时,会降低Taq DNA聚合酶的催化活性,得不到足够的PCR反应产物;过高时,非特异性扩增增强。此外,Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成等。在标准的PCR反应中,Mg2+的适宜浓度为1.5-2.0mmol/L。值得注意的是,由于PCR反应体系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低游离Mg2+的实际浓度,因此,Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-2.5mmol/L。如果可能的话,制备DNA模板时尽量不要引入大剂量的螯合剂(即EDTA)或负离子,因为它们会影响Mg2+的浓度。
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