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PCR仪的两大误区我们要注意了!

发布时间: 2022-01-19  点击次数: 267次
   PCR仪重要的就是升降温过程,起初的水浴锅式PCR,就是三个水浴箱,一个机械臂,定时抓出反应槽转换水浴锅。这种仪器体积大,迅速慢,但其实结果并不比以后的PCR仪差。后来有人利用致冷和加热做成了固定位置升降温的PCR扩增仪。后来随着定量技术的发展,有将扩增仪和检测做成一体,也就成了现在的实时荧光定量PCR仪。
  PCR仪的两大误区分析:
  1.仪器通道越多越好
  随着PCR技术的成熟运用,荧光定量PCR仪也是如此。从单通道荧光定量PCR仪发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量PCR仪,眼花缭乱的选择让人无所适从,稍不小心就可能走进“通道越多越好”的误区。
  在使用有些5通道的荧光定量PCR仪时,为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料),这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传的那么多。因此在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要。
  2.real-time PCR仪无需梯度功能
  对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题-在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在规定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出适合的反应条件。
  不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化-对于多种聚合酶混合酶扩增来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的佳反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。
  使用有梯度功能的荧光定量PCR仪可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程,简化了摸索PCR反应条件的繁琐实验,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。
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