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限制性内切酶的一般原则和建议

发布时间: 2022-06-24  点击次数: 213次
  限制性内切酶的一般原则和建议
  DNA中加上酶,然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中,我们不断听到:切不动,装不上。问题在什么地方?能系列生产限制性内切酶的公司国际上,就那么几个,位列前3的是NEB,Fermentas,SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题,但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。
  1)成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性),不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的EDTA(TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。
  2)选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。
  3)正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长TIP,避免污染。用完后需要及时送回原处。注意:酶通常是最后加。
  4)反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以了。
  5)模板浓度问题:浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会好。浓度过低,也会影响酶活性。
  6)注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。
  7)酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,shortspin一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。
  8)反应温度的选择。一般反应都用37度,但是SmaI的适合温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如TaqI的最适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的1/10。
  9)反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要*酶切可以采用少量的酶长时间反应,或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过1ul。
  10)是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段:加入高浓度的EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高,热处理灭活不一定*,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。
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