测序酶是基因测序、文库构建及分子诊断的核心工具，其活性与特异性直接影响数据质量与实验成败。在实际操作中，常因保存不当、反应体系失衡或模板质量问题导致扩增失败、偏好性偏差或背景噪音升高。科学识别
测序酶问题根源并采取针对性措施，是保障测序结果可靠性的关键。
一、扩增效率低或无产物
原因：酶失活、模板降解、引物设计不佳或Mg浓度不足。
解决方法：
确认酶活性：避免反复冻融，使用前短暂离心，按说明书要求在–20℃或–80℃保存；
检测模板质量：用Nanodrop或Bioanalyzer验证DNA/RNA完整性（A260/A280≈1.8–2.0，RIN＞7）；
优化引物Tm值与特异性，避免二聚体或发夹结构；
进行梯度PCR，调整Mg（通常1.5–3.0mM）或dNTP浓度。
二、非特异性条带或引物二聚体
多因退火温度过低或酶用量过多：
提高退火温度（建议比Tm低3–5℃起步），采用热启动型聚合酶抑制低温非特异扩增；
减少酶量（如从1U降至0.5U/50μL），避免过度延伸；
添加DMSO（3%–5%）或甜菜碱（1M）改善高GC模板扩增特异性。
三、测序文库产量低或片段分布异常
常见于NGS建库环节：
末端修复/加A尾不全：确保各步酶反应时间充足（通常20–30分钟），使用新鲜ATP；
接头连接效率低：控制插入片段与接头摩尔比（通常3:1–6:1），避免接头自连；
纯化损失过大：选用高回收率磁珠（如SPRIselect），严格控制乙醇洗涤次数与晾干时间。
四、逆转录失败（cDNA产量低）
使用无RNase耗材，RNA提取后立即反转录；
对长链或二级结构丰富的RNA，选用含RNaseH突变的高性能逆转录酶（如SuperScriptIV）；
添加随机六聚体+Oligo(dT)混合引物，提升覆盖均匀性。
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