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PCR仪对于菌落试验的基本步骤分析

发布时间: 2021-07-25  点击次数: 74次
   对于菌落试验来说按照一般的步骤,可以把每个菌落挑出来进行培养提取质粒,然后质粒进行测序或者酶切验证目的片段。但是从培养细菌到最后送测序,花费太多时间。如果说只有一个菌落去验证,那工作量倒不是很大。但万一有100个菌落就比较麻烦。那么我们就可以通过PCR仪进行菌落PCR筛选。
  基本步骤如下:
  1.单菌落挑取
  把LB培养基倒入排枪槽中,然后用排枪加400μL LB培养基到48孔深孔板,用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到48孔深孔板中,同时在48孔深孔板和相应的表单上做好记录,注意对于蓝白斑筛选的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜盖好并做好相应标记(日期、板号等),用针头在封口膜打孔,把它放在37摇床上摇一个小时。
  2.菌落PCR反应
  配置好PCR反应的反应体系,把配好的反应液加到96孔反应板中,用排枪加2.5μL的菌液到其中,注意在96孔反应板上做好标记。把96孔反应板放在PCR仪上盖好橡胶垫,按照PCR反应条件设置反应程序,注意一定要把PCR仪的盖子盖紧。
  3.琼脂糖凝胶电泳
  一般先配置1.0%-1.2%琼脂糖凝胶(即称1.2g的琼脂糖加100ml的TAE),在96孔反应板每个管中加0.5μL的溴酚蓝,震荡均匀,然后点样,电泳好的琼脂糖凝胶拍照,命名保存。
  4.判断阳性克隆并测序
  根据琼脂糖凝胶电泳图条带来判断阳性克隆,把阳性克隆的菌液进行扩大培养,进行测序验证,看看是否有完全正确的序列。
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