RAA等温扩增技术作为分子检测领域的新产物，突破了传统PCR对热循环仪的依赖，可在37-42℃恒温条件下实现靶标DNA/RNA的快速扩增，广泛应用于现场快检、基层医疗与应急防疫。
RAA等温扩增的高灵敏度与便捷性，要求使用者掌握严谨、规范的操作流程，以避免污染、假阴性或结果漂移。
第一步：环境准备与试剂预平衡
在独立的核酸操作区进行，遵循“三区分离”原则（试剂准备、样本处理、扩增检测）。从-20℃冰箱取出RAA试剂盒，置于冰上缓慢解冻。使用前将所有组分（引物探针、缓冲液、酶混合液）短暂离心，确保管壁无残留。工作台面用75%乙醇或DNAAway清洁，开启生物安全柜并紫外照射15分钟。
第二步：反应体系配制
按说明书比例在无菌PCR管中加入：
RAA缓冲液（含dNTPs、Mg??）；
上下游引物与荧光探针（FAM/TAMRA标记）；
RAA酶混合液（含重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶）；
无核酸酶水补足体积。
每批次设阳性对照与阴性对照（用水代替模板），防止假阴性或污染误判。
第三步：模板加入与混匀
将提取好的DNA/RNA模板（通常1-2μL）加入反应管，轻弹混匀，短暂离心。注意更换枪头，避免交叉污染。若检测RNA，需先经逆转录酶处理为cDNA，或使用RT-RAA一步法试剂盒。
第四步：恒温扩增
将反应管放入预热至39±1℃的干式恒温仪或水浴锅中，盖紧盖子防止冷凝水进入。扩增时间通常为10-20分钟。部分封闭式设备可实时监测荧光信号，实现定量分析。
第五步：结果判读
扩增结束后，立即读取荧光信号：
荧光法：FAM通道荧光值超过阈值线且呈S型上升曲线为阳性；
试纸条法：取扩增产物滴加侧向流试纸条，出现T线与C线为阳性。阴性对照应无信号，阳性对照应有效扩增，否则实验无效。
第六步：废弃物处理与记录
所有耗材（枪头、离心管）按生物危险废物处理，高压灭菌后丢弃。填写实验记录，包括样本编号、试剂批号、仪器参数、结果与操作人员。
您的位置：