PCR仪是分子生物学、临床诊断与病原检测中的核心设备，通过实时监测荧光信号，实现对核酸模板的精确定量与扩增分析。其结果准确性高度依赖规范的操作流程。任何细微偏差，如样本污染、程序设置错误或耗材不匹配，都可能导致假阳性、假阴性或数据重复性差。掌握
PCR仪的正确使用方法，是保障实验科学性与可靠性的关键。
一、实验前准备：环境与耗材合规
实验室分区：严格遵循“试剂配制区→样本处理区→扩增区”单向流，避免交叉污染；
耗材选择：使用仪器兼容的光学平盖PCR管/板（如0.2mL8联管或96孔板），确保透光率高、热传导均匀；
试剂预混：MasterMix在冰上配制，轻柔混匀，避免气泡；离心短暂甩液，确保液体沉底。
二、样本加载与密封
加样精准：使用校准移液器，每孔体积一致（通常10-20μL），避免挂壁或溢出；
密封严密：盖紧光学平盖或使用专用封板膜，防止蒸发导致浓度变化；
避光操作：荧光染料对光敏感，加样后尽快放入仪器。
三、程序设置科学合理
标准三步法：
预变性：95℃30-120秒（激活热启动Taq酶）；
循环扩增：95℃5-15秒（变性）→60℃30-60秒（退火/延伸+荧光采集）；
循环数：通常40-45cycles；
熔解曲线分析（SYBRGreen必做）：65℃→95℃，每0.5℃读取荧光，验证扩增特异性；
避免过度循环：超过平台期将降低定量线性范围。
四、仪器操作规范
校准与验证：定期进行温度均一性与荧光校准（按厂家建议，通常每6个月）；
放置位置：PCR板居中放置，确保所有孔受热与检测条件一致；
运行中勿开盖：防止温度骤降与荧光信号丢失。
五、数据分析与质控
设置对照：必须包含无模板对照（NTC）、阳性对照及内参基因；
阈值设定：自动或手动调整Ct阈值线，位于指数扩增期起始段；
重复性要求：技术重复Ct值差异应≤0.5，否则需排查加样误差或模板降解。
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