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内切酶的酶切技术实验原理值得关注!

发布时间: 2021-06-22  点击次数: 49次
   内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶,目前已从多种细菌中分离出超过400种,识别各自不同的核苷酸顺序,这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列,如从大肠杆菌中分离的EcoR I识别:…GAATTC…切割后产生
  …CTTAAG…
  …G和AATTC…的末端
  …CTTAA G…
  该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出,故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团。即…G-OH
  …CTTAA-P。
  有的限制性酶识别四碱基对的顺序,如San3A识别GATC;有的识别六碱基对,如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高(四碱基酶为44=256,六碱基酶为46=4096),因而可将DNA切割成更小的片段,而识别八碱基对的Not I
  …GCGGCCGC…
  …CGCCGGCG…。
  则识别和切割位点更少(48=65536),但碱基并不以均等的概率出现,因而切割后产生的片段变化范围很大。
  限制性内切酶作用的温度一般为37℃,反应体系中以Mg2+为单独的辅助因子,且要求pH缓冲在7.5左右。
  商品酶都保存在50%的甘油溶液中,-20℃贮存,活性通常较高,5u/μl(每单位即最适条件下1小时内完全酶解1μg DNA的酶量)。
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