默瑞生物提供近岸系列体外合成酶及试剂，解决mRNA疫苗的关键痛点

默瑞生物提供近Novoprotein近岸蛋白质一系列mRNA体外合成酶及试剂，解决mRNA疫苗的关键痛点。所有产品均采用药用规格原辅料生产，严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留及常见病原体污染，符合GMP规范的产品生产与质量管理规程，保障生产过程及所有原辅料可追溯。

　　产品特点：

　　*GMP级mRNA体外合成及修饰原料，animal-free，ampicillin-free

　　*产品生产、质量控制及配套文件体系，符合mRNA疫苗及药物研发生产需求

　　*经过临床使用验证，单批次产能千万人份，年产能50亿人份

　　mRNA疫苗的成功需要保证mRNA的稳定性和高效翻译效率以及mRNA的大量生成。

　　1、生成模板-质粒线性化 相关产品：Bsa I，GMP Grade(货号：GMP-RE026)

　　此步将构建好的质粒酶切，处理成线性化双链DNA模板，用于下一步mRNA合成。

　　限制性内切酶Bsa I 特异性识别双链DNA中位点并进行酶切，可将模板质粒酶切线性化，作为mRNA体外合成模板;

　　酶切位点：

　　产品特点：

　　强特异性

　　受CpG、Dcm甲基化影响，剪切阻断

　　受EcoBI甲基化影响，剪切可能受影响

　　不受Dam甲基化影响

　　2、mRNA体外合成

　　此步以DNA为模板，在体外由RNA聚合酶催化合成mRNA。

　　T7 RNA Polymerase(T7 RNA聚合酶)是高度特异识别T7启动子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。T7 RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。

　　产品特点：

　　高度特异识别T7启动子

　　20ul反应体系，产量可达150ug

　　可对低至1ng模板进行有效转录

　　合成长度可达15k

　　体外转录产生的mRNA，Qsep1结果显示，纯度高，均一性好。

　　3、mRNA转录后修饰：加帽加尾

　　此步对mRNA进行修饰，合成功能完整的mRNA。

　　完整mRNA结构

　　3.1、mRNA加帽(Cap0)   

　　此步与3.2同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构，再将Cap0转化为Cap1结构。

　　在真核生物中，转录后的mRNA必需经过一系列修饰才能形成完整的结构，即在5'端形成一个帽子结构(Cap1)，3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。

　　Vaccinia Capping Enzyme(牛痘病毒加帽酶)用于给体外转录合成的mRNA催化加上帽子结构(Cap0)，显著改善mRNA的稳定性和翻译能力，使mRNA可在细胞内表达蛋白，避免核酸外切酶等的降解破坏。

　　mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2-O甲基转移酶(Cat. No: GMP-M072, Novoprotein)参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。

　　产品特点：

　　高效完成mRNA加帽Cap0

　　提高mRNA的稳定性，防止被RNA酶降解

　　提高mRNA的翻译效率，提高蛋白产量

　　3.2、mRNA加帽(Cap1)

　　此步与3.1同时进行，在mRNA的5'端加上Cap0帽结构，再将Cap0转化为Cap1结构。

　　真核生物中，mRNA的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。已知Cap1结构存在于所有真核生物mRNA，在稳定mRNA结构和提高翻译效率方面起重要作用。研究表明，体外转录修饰得到的Cap1结构mRNA更不容易被免疫系统的RNA感受器(RIG-I)识别，因此免疫刺激更低。

　　mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas (2´-O-甲基转移酶)可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体， 在 RNA 5´末端紧邻帽结构(Cap 0)的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团，形成带有 Cap 1 结构的 mRNA。Cap1 结构能增强 mRNA 的翻译效率，从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 为底物，不会作用于 5´末端为pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 可通过 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)来制备。

　　产品特点：

　　使mRNA的Cap 0帽子甲基化为 Cap 1帽子

　　提高 RNA 的翻译效率，提高蛋白产量

　　进一步降低免疫原性

　　完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白，加帽酶与帽类似物对比

　　3.3、mRNA加尾(PolyA)

　　此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。

　　真核生物中，mRNA的转录后须经系列修饰，在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，3’端形成PolyA尾结构。这些结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。Poly A与成熟mRNA的稳定性、翻译起始以及出核运输有关，体内转录后修饰中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。

　　体外转录RNA过程中，E. coli Poly (A) Polymerase(加尾酶) 不依赖模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次掺入到 RNA 的 3´末端，即在 RNA 的 3´末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3´末端加入 20~200 个 A 碱基。 还原体内加尾过程。

　　产品特点：

　　稳定mRNA的存在形式

　　引导转录终止

　　提高RNA在真核细胞中的翻译效率

　　4、其他相关产品

　　4.1、防止mRNA降解

　　在流程2-3 mRNA合成与修饰中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。

　　RNase Inhibitor可与RNase A形成1：1复合体，对RNase 有*非竞争性抑制，保护mRNA转录后不被降解

　　产品特点：

　　强抑制RNase活性

　　稳定性强

　　4.2、降解模板DNA

　　在流程2 RNA合成结束后，去除模板DNA。

　　DNase I将单链或双链DNA随机分解。

　　DNase I 去除RNA样本种的DNA残留

　　4.3、增加mRNA产量

　　在流程2 RNA合成过程中加入无机焦linsuan酶，增加RNA产量。

　　无机焦linsuan酶PPase(Pyrophosphatase, Inorganic)可催化无机焦linsuan盐水解生成正linsuan盐(P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2)，一方面可去除无机焦linsuan盐对反应体系的抑制，另一方面为反应提供热力学动力，促进产物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白质的生物合成中，是一种良好的辅剂，在mRNA疫苗体外大规模合成中加入可显著提高产量。

　　无机焦磷酸酶去除mRNA合成过程中产生的焦磷酸，提高mRNA产量

　　相关清单