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PCR仪有关的分子信标技术介绍

发布时间: 2021-12-20  点击次数: 249次
   随着PCR技术的发展与广泛应用,利用PCR的定量技术也取得了长足的发展。早期主要采用外参照的定量PCR方法,这种方法因影响因素较多,现已逐渐被内参照物定量方法和竞争PCR定量方法所取代,并在此基础上发展了荧光定量PCR仪方法,使PCR定量技术提升到新的水平。
  分子信标技术也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和猝灭分子。通常,分子信标探针长约25核苷酸,空间上呈茎环结构。与TaqMan探针不同的是,分子信标探针的5'和3'末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构,此时荧光分子和猝灭分子邻近,因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时,该探针与模板杂交,从而使探针的发夹结构打开,于是溶液便产生荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR仪的定量分析。该方法的特点是采用非荧光染料作为猝灭分子,因此荧光本底低。
  常用的荧光猝灭分子对是5'-(2'-氨乙基氨基萘-1-磺酸)(EDANS)和4'-(4'-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(DAB-CYL),采用DAB-CYL作猝灭剂是由于它对多种荧光素都有很强的猝灭效率。当受到336nm紫外光激发时,EDANS发出波长为490nm的亮蓝荧光;DAB-CYL的是非荧光分子,但其吸收光谱与EDANS的发射荧光光谱重叠。只有分子信标时,EDANS和DAB-CYL的距离非常接近,足以发生FRET,EDANS受激发产生的荧光转移给DAB-CYL并以热的形式散发,不能检测到荧光;相反,当有靶核酸存在时才可检测到荧光。
  分子信标技术的不足之处是:
  杂交时探针不能完全与模板结合,因此稳定性差;
  探针合成时标记较复杂。分子信标技术结合不同的荧光标记,可用于基因多突变位点的同时分析。
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